细胞培养—小白从零到精通
细胞是生命的基本单位，是生物学研究中非常有用的工具。细胞培养的过程就是人工模拟细胞体内生长环境，置于无菌、适宜温度及酸碱度的环境中，保证充足的营养使其不断生长繁殖，并维持其结构和功能。作为基础又必备的实验技能，自然颇受关注。
一、如何正确选择培养体系
1.培养体系的选择
主要分为含血清的经典培养体系和无血清培养体系。简单、细胞种类、小规模选择含血清培养体系；长周期、强掌控、追求细胞质量可选择无血清培养体系。
|
|
含血清 |
无血清 |
|
实验条件 |
简单 |
需要实验摸索 |
|
培养周期 |
短，3-4天 |
长，7天以上 |
|
批次间差异 |
大，干扰因素多 |
小，实验条件可控 |
|
培养规模 |
较小 |
容易放大 |
|
细胞种类 |
多 |
少 |
2.含血清无血清实验条件简单需要实验摸索
培养周期短，3-4天长，7天以上批次间差异大，干扰因素多小，实验条件可控培养规模较小容易放大细胞种类多少。
血清的选择分为胎牛血清、新生牛血清、小牛血清；其中胎牛血清的普适性最强。血清主要为细胞提供基本的营养；血清中的微量元素可参与细胞的解毒代谢；血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保护细胞的作用。当然，具体细胞使用何种血清可以参考相关文献或者实验组的经验。
|
|
胎牛血清 |
新生牛血清 |
小牛血清 |
|
采 血 时 间 |
4-9月龄胎牛心 脏穿刺采血 |
出生后二周内新 生牛静脉采血 |
1 2 个 月 内 小 牛动脉采血 |
|
生 长 因 子水平 |
高 |
较高 |
低 |
|
价 格 水 平 |
高 |
较高 |
低 |
3.基础培养基的选择
基础培养基的选择：根据培养基的来源和组成成分，分为天然培养基(组织提取液)、合成培养基(经典液体培养基如1640、DMEM等)、无血清培养基。目前合成培养基和无血清培养基使用居多。
4.抗生素的选择
目前实验室会在细胞培养过程中添加双抗(青霉素-链霉素)或者三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)用来预防细胞污染，但是对于长期的细胞培养并不建议持续使用抗生素，以防细胞产生耐药性。
5.培养基中酚红的选择
作为PH指示剂，酚红是培养基的“常客”。酚红为雌激素类
似物，在进行激素诱导或培养雌激素敏感的细胞时应慎用，另外酚红可能对下游的流式检测分析带来一定的干扰。
二、细胞来源
1)从有资质的公司直接进行购买：比如澳培赛可提供全面的原代细胞及优化后适配的培养基，试剂和方案；ATCC官网作为全球权威的生物资源中心之一，提供原代细胞、细胞系、微生物、重组物质等。
2)从生物体中提取制备：如血液样本、实体组织样本等。关于样本制备成单细胞悬液的内容大家可以参考《样本制备》的内容进行学习。
3)实验室现有的冻存细胞复苏获得
三、细胞培养基本原则
01无菌意识
使用无菌设备、试剂和耗材；使用个人防护装备，避免污染；试剂如有需要可使用0.22μm的过滤器进行无菌过滤；每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染，实验进行前，超净台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台面；实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%乙醇擦拭无菌操作台面。
02试剂分装
培养基、血清、胰酶等试剂要养成分装保存的习惯，不同的细胞即使适配的培养基配方相同也要另外配制分装并做好标记。
03及时保种
尤其是珍贵细胞，在细胞状态良好的时候要及时冻存保种，以备不时之需。
04细胞传代
随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再进行培养，这个过程就称为传代(passage)
该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法
a)收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、
镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。
b)加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中
(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL)置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入5-6ml含10%FBS的培养基来终止消化。
c)将收集到的悬浮细胞、PBS清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min,弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
悬浮细胞传代：
(1)收集细胞悬液；
(2)离心(1000转/分，2分钟);
(3)弃上清；
(4)加入新鲜培养基重悬细胞；
(5)按照适当比例接种到新的培养皿；
(6)补足培养基；
(7)放于温箱培养。
贴壁细胞的传代：
(1)吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面。
(2)加入胰酶消化细胞；
(3)加入新鲜培养基终止胰酶消化；
(4)将细胞吹打下来，收集，离心；
(5)弃上清；
(6)加入新鲜培养基重悬细胞
(7)按照适当比例接种到新的培养皿
(8)补足培养基；
(9)放于温箱培养。
05细胞复苏
复苏细胞：以下细胞复苏处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含8mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心5min,弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。
复苏流程：
(1)取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。
(2)取出冻存的细胞，于37℃的温水中，1min之内迅速融化。
(3)迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离
心1分钟。
(4)弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。
(5)接种到培养皿(瓶)内，补足培养基，放入温箱培养。
06细胞冻存
悬浮细胞的冻存：
(1)配制冻存液(胎牛血清：二甲基亚砜9:1),每个冻存管需要冻存液1ml。
(2)收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80℃冰箱，第二日转存于液氮中。
贴壁细胞的冻存：
(1)配制冻存液。
(2)弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、
分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80℃冰箱，第二日转存于液氮中。
细胞冻存的注意事项：
(1)冻存液要最先配置。
原因一：二甲基亚砜(DMSO)在加入血清时会产热损伤细胞
原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO,则局部DMSO浓度过高，会对细胞造成严重损伤(DMSO在室温下对细胞有害),影响日后的复苏。
(2)冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。
(3)最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。
(4)冻存时要缓慢降温(慢冻),用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃,细胞冻存盒应先放在4℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻存盒，则采用程序降温法。(4℃冰箱40min,-20℃冰箱30-60min,置于-80 ℃过夜，次日转入液氮)
